Alvéole - Take care of your cells

Primo

La première solution
de photopatterning multi-protéines

Contrôlez plusieurs paramètres du microenvironnement cellulaire et étudiez leurs impacts sur le développement des cellules avec une solution inédite de photopatterning multi-protéines.

Technologie

Depuis quelques années, l’étude de l’influence du microenvironnement sur les mécanismes intra et intercellulaires est primordiale pour la recherche en biologie cellulaire et médicale. Parmi les méthodes de contrôle de ce microenvironnement, le « micropatterning » qui consiste à créer des motifs (ou patterns) de protéines sur lesquels sont cultivés les cellules vivantes est en plein développement. Cependant, les techniques actuelles de micropatterning s’avèrent fastidieuses, complexes et non quantitatives.

Partant de ce constat, les scientifiques d’Alvéole ont développé une technique innovante de photopatterning multi-protéines pour faciliter les manipulations expérimentales des chercheurs.

PRIMO s’appuie sur la technologie LIMAP* (Light Induced Molecular Adsorption of Proteins) et associe un système d’illumination UV, contrôlé par un logiciel dédié (Leonardo), et un réactif photo-activable spécifique (PLPP). L’action combinée de ces deux composants spécifiques permet de générer en quelques secondes n’importe quel motif avec plusieurs protéines sur les supports standards de culture cellulaire.

*« Multiprotein Printing by Light-Induced Molecular Adsorption » Strale P.O. et al, Adv Mater. 2015

Applications

Primo a été imaginé pour vous permettre de concevoir et mener toutes les expériences de micropatterning que vous imaginez, en 2D et aussi en 3D. Il vous suffit de sélectionner parmi les fichiers de votre ordinateur le motif que vous voulez utiliser (aucune limite de taille ou de forme). PRIMO le projette ensuite sur le support de culture cellulaire et vous permet de créer le pattern avec la protéine de votre choix.

Nous découvrons progressivement l’étendue des champs d’applications de cette nouvelle technologie et nous sommes heureux de vous présenter quelques unes des premières expériences réalisées par nos utilisateurs.

Micropatterning personnalisé

Cellules de tératocarcinome de souris étalées sur des micropatterns de fibronectine.

Micropatterning de cellules uniques

Fibroblastes disposés sur des motifs rectangulaires de fibronectine (après 2 semaines).

Etude du cytosquelette

Fibroblastes embryonnaires de souris "knock-out vimentine" sur des patterns de fibronectine + fibrinogène-A647 (bleu) de différentes formes, actine marquée avec phalloidine-A555 (rouge) et adhésions focales visibles via Anticorps Anti-Paxiline + Anticorps secondaire couplé à A488 (vert).(1)

Contrôle dynamique de la migration cellulaire collective

Des cellules HeLa sont ensemencés sur un pattern de fibronectine en forme d'anneau. Après ajout de PLPP et l'illumination du centre de l'anneau aux UV, les molécules anti-adhésives sont retirées et les cellules migrent vers l'intérieur.

Cell co-culture

Cellules S180 et cellules MEF déposées successivement sur un motif Yin & Yang (Yin : fibronectine, Yang : streptavidine incubée avec de la fibronectine biotinylée).(2)

Patterning et neurobiologie

Test cellulaires sur des astrocytes, d’abord sans patterning
Astrocytes étalés sur une couche uniforme de fibronectine et dont les formes sont hétérogènes.(3)
Microtubules marqués à la GFP : leur orientation hétérogène ne permet pas de faire des mesures de vitesse de croissance.(3)
Tests cellulaires sur des astrocytes, avec patterning
Astrocytes étalés sur des lignes de fibronectine.(3)
Les microtubules, marqués à la GFP, présentent alors la même orientation : des mesures de vitesse de croissance sont désormais possibles.(3)
Guidage axonal
Explant de cerveau de poulet positionné au centre d’un motif de laminine marquée avec alexa488 (vert) en forme de roue.(4)
Guidage axonal sur les rayons et la circonférence du motif de laminine en forme de roue (vidéo time-lapse de 24 heures).(4)

Micro-organ-on-a-chip

3 hépatocytes HepG2 qui adhèrent à des motifs de fibronectine sur les côtés et le fond de micro-puit.(5)

Microfabrication pour la microfluidique

Moule en relief en résine SU8 permettant de fabriquer des puces microfluidiques, réalisé avec PRIMO (projection du masque virtuel et exposition UV).
Zoom sur les motifs du moule en résine SU8.
  1. Avec la permission de A.J. Jimenez et B. Vianay, Physics of cytoskeleton & Morphogenesis lab.
  2. Avec la permission de V. Studer et P.-O. Strale. ”Multiprotein Printing by Light-Induced Molecular Adsorption“ Strale P.-O. et al., Adv Mater. 2015
  3. Avec la permission de C. Delépine. ”Altered microtubule dynamics and vesicular transport in mouse and human MeCP2-deficient astrocytes“, Delépine C. et al., Hum. Mol. Genet. 2015.
  4. Avec la permission de H. Ducuing, R. Moore, Y. Lecomte, P.-O. Strale et V. Studer.
  5. Avec la permission de C. Stoecklin et V. Viasnoff

Perspectives

PRIMO permet d’ajuster précisément, facilement et rapidement les micropatterns de protéines, que ce soit pour étudier l’effet d’une molécule ou imiter les conditions physiologiques. Il ouvre donc de nouvelles possibilités pour de multiples domaines d’applications, tels que la recherche sur les cellules souches, les tests cellulaires pour la mise au point de médicaments et la toxicologie prédictive* pour répondre à des enjeux majeurs de santé publique.

Cancer
Immunologie
Neurobiologie
Médecine régénératrice

*Les tests cellulaires effectués avec la technique du micropatterning constituent une excellente alternative aux tests sur les animaux.

Caractéristiques

Trois composants spécifiques

PRIMO : un boitier d’illumination UV. Monté sur un microscope, son système optique d’imagerie projette le motif que vous désirez sur les supports standards de culture cellulaire.

PLPP : un réactif photo-activable exclusif. Couplé à l’action des UV, il permet de créer le motif sur la zone illuminée du support. Vous pouvez ainsi y déposer précisément la protéine de votre choix.

LEONARDO : le logiciel qui vous procure un contrôle optimal du boitier PRIMO et facilite vos manipulations expérimentales.

PRIMO® est une marque déposée de la SAS Alvéole. PLPP™ est une marque de la SAS Alvéole.

Le logiciel de photopatterning intégré

Des performances inégalées

Image projetée
Image obtenue par photopatterning de 3 marqueurs fluorescents (PEG-FITC, PEG-TRITC, PEG-Atto647) déposés successivement.
Photopatterning successif de Fibrinogène-A488 en vert et Protéine A-A647 en rouge sur des micropiliers de PDMS microfabriqués avec PRIMO.

Témoignages clients

Virgile Viasnoff

Professeur Associé au MechanoBiology Institute - National University of Singapore, et Directeur de Recherche au CNRS

« My research work consists in understanding how microenvironmental cues influence, guide and shape cell-cell contacts. We are currently particularly interested in determining the role of the biophysical environment in the establishment of apico-basal polarity in mammary gland cells and in liver cells. The use of PRIMO in this context proved absolutely essential since it allowed us to create artificial microniches in 3D where we could control up to 150 combinations of environmental cues.

By printing our protein of choice and microfabricating intricate structures under the microscope, we are gradually uncovering how the geometrical and biophysical parameters drive the elongation of lumen into tubes in the context of hepatic development and diseases.

PRIMO is unique in its capabilities, and for us it is the perfect tool. Submicron-resolution, flexibility and versatility in terms of the proteins you can deal with. It is a very reliable tool to print proteins on surface. »

Combining topographical cues and biochemical cues at cell aggregate level by addition of a micro-pillars base layer. Patient-derived head and neck cancer cell aggregates (HN cells) were grown into 60 µm diameter and 30 µm height micro-niches with Laminin (green) homogeneously coated on the pit walls, and fibronectin (red) coated on the NOA 73 micro-pillars (2 m height and diameter).

Olivier Théodoly

Directeur du Laboratoire “Adhésion & Inflammation” - INSERM

« The team is studying the recruitment mechanisms of white blood during an immune response. The complex orchestration of white blood cells traffic between blood/lymph systems, lymph nodes and inflammation zones relies on sophisticated but still poorly understood signaling routes that guide cells toward precise targets. Our aim is to develop in vitro experimentation to decipher guiding mechanisms involved in vivo.

PRIMO technology is particularly adapted to design in vitro microdevices patterned with controlled patches of the signaling proteins relevant for white blood cell migration. »

Primary human T lymphocytes on specific adhesion strips.

Benoit Vianay

CEA Engineer au Laboratoire Physics of cytoskeleton & Morphogenesis (Cytomorpholab)

« We are working on the generation of 3D cellular microenvironments to reproduce hematopoietic niches. Primo will be used to generate 3D photopolymerised microenvironments and to pattern them to localize different cell populations involved in the hematopoiesis.

We initially chose to use PRIMO because it allows sequential multi patterning and makes gradient patterning possible. It works with a broad range of scale and its design creation is limitless. The technology is reproducible and robust after good practical and highly performant to prototype designs or protein combinations. »

RPE1 cells on an Eiffel Tower micropattern generated with PRIMO using Fibronectin and Fibrinogen-Alexa647.

Shrikrishnan Sankaran

Research Scientist au INM-Leibniz Insitute for New Material

SKBR3 cells spread over Fibronectin-Rhodamine patterns.

« We are interested in imaging subcellular localization of certain cell surface receptors and check whether they colocalize with focal adhesion complexes. For this purpose we are interested in making different types of patterns of Fibronectin with subcellular dimensions. We decided to use PRIMO because our lab uses photoresponsive ligands to make dynamic biomaterials, so in general this was a useful tool for most of our members. In particular, it suited my requirement of making patterns with different dimensions and features and being able to immobilize any protein of interest onto it. »

Mélanie Chabaud

Post-Doctorante à UNSW Sydney

« My research project aims at unravelling how a T cell switches from a fast migratory state to a stationary state upon activation. To do so, I perform live cell imaging of T cells migrating inside micro-fabricated channels coated with activating molecules. However, with this approach, I do not control when and where a T cell encounters the activating molecules. The use of PRIMO allows me to print a “migratory zone” and an “activation zone” along micro-channels to visualize this transition. And I also chose to use PRIMO for its capacity to print proteins on 3D surfaces and because it enables me to fine-tune the printing area on a per experiment basis. »

Single lymphocyte (cell nucleus staining with Hoechst) migrating in a microchannel patterned with a migratory zone (fibronectin) and an activating zone (anti-CD3 Abs).

Oleh Halaidych

Etudiant en doctorat au Leiden University Medical Center, Anatomy and Embryology Lab.

L’équipe souhaitait utiliser un système flexile pour réaliser du patterning de plusieurs protéines différentes et des gradients sur plusieurs types de substrats. Après quelques semaines d’utilisation, Oleh a partagé avec nous son opinion sur la technologie : « If I should use one word to characterize PRIMO, I would say mind blowing, impressive or unbelievable. »