Générez de meilleurs échantillons cellulaires pour vos expériences de cryo-tomographie électronique!

La Cryo-EM est en plein essor pour l’imagerie des molécules intracellulaires. Cependant, la cryo-ET avec des échantillons cellulaires se révèle encore assez difficile d’accès. En effet, avant même d’envisager d’accéder au microscope, l’échantillon cellulaire doit répondre à certaines exigences de base: être localisé sur des emplacements spécifiques sur la grille de TEM, contenir le composant ciblé, être suffisamment mince pour la microscopie électronique en transmission.

En contrôlant l’adhésion, l’étalement et la forme des cellules, le micropatterning avec le système PRIMO sans masque et sans contact surmonte les problèmes rencontrés lors de la toute première étape du procédé de préparation des échantillons cellulaires pour la cryo-ET.

Il offre des avantages uniques pour vos expériences en TEM et cryo-ET sur cellules entières:

  • Positionnement précis des cellules: alignement automatique dans le maillage des grilles EM!
  • Etalement optimisé : épaisseur cellulaire réduite pour des workflows plus efficaces en CLEM et cryo-ET
  • Modèles cellulaires standardisés: micropatterning reproductible pour les études de mécanobiologie
  • Surface préservée : micropatterning sans contact préservant l’intégrité de la surface de la grille EM

Positionnement cellulaire précis dans le maillage des grilles TEM

Le logiciel Leonardo détecte le maillage des grilles TEM et aligne automatiquement vos patterns à l’intérieur de celui-ci, pour que PRIMO génère des micropatterns parfaitement alignés. Le système PRIMO garantit ainsi que les cellules seront bien positionnées dans le maillage de vos grilles TEM!

(a) Cryo-SEM of HeLa cells on a standard gold-mesh grid. Cyan circle indicates grid center. Arrowheads indicate the cells optimally positioned for FIB-lamellae preparation.

Et assurez-vous ainsi d’avoir des cellules positionnées de façon optimale pour le FIB-milling et la cryo-ET!

Toro-Nahuelpan et al., BioRxiv, 2019
(e) FIB shallow angle view on cell framed in (b). Yellow rectangles indicate patterns for milling. (f) Final lamella produced from cell in (e). (g) Tomographic slice, 6.8 nm thickness, of the nuclear periphery of the cell in (e). Lamella thickness determined from the tomographic reconstruction was 90 nm. NPC: nuclear pore complex; MT: microtubule.
Micropatterned neurons on EM grid - Elizabeth Wright
Maskless photo micro-patterning and cryo-EM of primary neurons derived from Drosophila melanogaster larvae. (A) Live-cell fluorescence microscopy of Drosophila neurons expressing membrane-targeted GFP on photopatterned grid squares with fluorescent concanavalin A. Green: Drosophila neurons. Light blue: Micropatterns done with PRIMO. (B, C) Magnified live-cell imaging view of two regions from (A) showing ordered arrangement of the neurons along the photopatterned regions. (D) Cryo-EM grid low magnification map of the same grid in (A) after plunge-freezing. Green circle indicates the same grid square imaged in (E). (E) Higher magnification images collected of the neurites. (F) Cryo-EM image acquired from a region of the green circle in (D). Various structures can be seen in the image, such as the cell membrane, microtubules, vesicles, and actin. Courtesy of Joseph Y. Kim, Bryan S. Sibert, Jie E. Yang, and Elizabeth R. Wright - Cryo-Electron Microscopy Research Center & Department of Biochemistry, University of Wisconsin - Morgridge Institute for Research, Madison.

Etalement cellulaire optimisé sur les grilles TEM grâce au micropatterning

En contrôlant la surface adhésive disponible et l’adhérence cellulaire sur les grilles TEM, le système de micropatterning PRIMO peut moduler l’étalement cellulaire. Et la propagation des cellules à son tour peut être un atout clé pour améliorer le débit de la tomographie cryoélectronique sur cellules entières. En effet, l’étalement facilite l’identification (CLEM), la préparation (FIB-milling, parfois même non nécessaire si l’échantillon est suffisamment fin) et l’imagerie (cryo-ET) des structures intra-cellulaires ciblées.

Lattice micropatterning improves throughput for cryo-ET of cell-cell contacts.
Lattice micropatterning improves throughput for cryo-ET of cell-cell contacts.

Le micropatterning pour des modèles cellulaires standardisés

Le micropatterning est connu comme un moyen efficace de contrôler l’adhésion cellulaire in vitro. Cette technique est donc largement utilisée pour standardiser la forme des cellules ainsi que leur organisation interne (directement liée à des facteurs d’adhérence externes).

Avec sa capacité unique à aligner automatiquement les micropatterns dans le maillage des grilles TEM, le système de micropatterning PRIMO apparaît comme l’outil parfait pour mener des expériences de cryo-ET homogènes et standardisées.

Pour aller plus loin, l’utilisation du micropatterning PRIMO pour des observations en cryo-ET sur des cellules pourrait aider à cibler précisément des éléments internes spécifiques lorsque les approches d’imagerie corrélative s’avèrent trop difficiles, comme le soulignent M. Toro-Nahuelpan et al. *

Cytoskeleton study on live cells on EM grids - M. Toro-Nahuelpan et al., BioRxiv, 2019
(a) On-grid live-cell confocal microscopy of actin organization in RPE1 LifeAct-GFP cells grown on micropatterns done with PRIMO (gold-mesh, SiO2 film R1/4). Positioning of actin stress fibers (yellow arrowheads) correlate with the distinct patterns. Blue arrowhead: actin rings composed of putative bundles. (h-i)
Cryo ET cytoskeleton study on micropatterned cell. M. Toro-Nahuelpan et al., BioRxiv, 2019
M. Toro-Nahuelpan et al., BioRxiv, 2019

Surface des grilles de TEM préservée!

En tant que système de photopatterning sans masque et sans contact, PRIMO peut projeter vos micropatterns en lumière UV sur la surface des grilles TEM sans compromettre leur intégrité!

Maskless photopatterning of EM grids using PRIMO system. L. Engel et al., BioRxiv, 2019.
Maskless photopatterning of EM grids using PRIMO system. L. Engel et al., BioRxiv, 2019.
ECM protein micropatterns
Left: High resolution, large area ECM protein micropatterns of arbitrary geometry patterned on holey carbon EM grids (200 mesh) with PRIMO maskless photopatterning. Squares have side lengths of 24.8 and 32.4 μm. Circles are 27.9 and 36.6 μm in diameter. The shapes are positioned between the

Webinars et tutoriels: Plus d’informations sur l’utilisation du système PRIMO pour la cryo-ET

Vous trouverez ci-dessous plusieurs outils pour vous permettre d’approfondir plus en détails l’utilisation du système de micropatterning PRIMO pour des expériences cryo-ET.

Digging deeper into cellular mechanisms with micropatterning and cryo-ET

Watch this tech talk from Cell Bio 2020 to see how micropatterning and cryo-ET can accelerate research breakthroughs on what really goes on in the cellular machinery at the molecular scale!

Speakers: Drs. Pierre-Olivier Strale, Leeya Engel, Matthijn Vos, and Léa Swistak, PhD Student

Watch the replay
Screenshot Tech talk Alveole Cell Bio 2020

Advancing Cell Biology with Correlative Cryo-Microscopy

Pr. Elizabeth R. Wright (Morgridge Institute for Research University of Wisconsin-Madison).

Learning Objectives:
  • Discussion on results: infectious disease, neurosciences.
  • Review of needed equipment / techniques for successful whole-cell cryo-ET.
  • Tips for defining and optimizing important parameters for advanced whole cell cryo-microscopy workflow.
Watch the replay
Screenshot webinar no3 cryo-CLEM series

Webinar Micropatterning on EM grids

Webinar and Q&A with Dr Leeya Engel (Stanford university): “Micropatterning on EM grids: A strategy for improving cell cryo-ET workflow”, based on the outcomes of her paper (L. Engel et al., JMM, 2019) using PRIMO maskless photopatterning.

Webinar Nature sponsored by Alvéole- Leeya Engel - Micropatterning on EM grids: A strategy for improved cellular cryo-ET workflow. Using PRIMO technology by Alvéole.

Tutorial video: Micropatterning on TEM grids

Homogeneous micropatterns automatically positioned within the mesh of a TEM grid, without damaging its surface:

  • One repeating pattern
  • Different series of micropatterns
Tutorial video PRIMO micropatterning alignment on TEM grids

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